研究背景
益生菌通過維持腸道微生物群穩(wěn)定和緩解疾病癥狀，為宿主帶來健康益處。羅伊氏粘液乳桿菌（Limosilactobacillus reuteri）是一種典型益生菌，具有多種益生特性，推測其基因組中存在許多重要功能基因，因此有必要在基因組水平上進(jìn)行分析。Kong等通過全基因組測序證明豬源羅伊氏粘液乳桿菌TPC32具有治療腸道炎癥的生物學(xué)功能和治療潛力。Morita等通過羅伊氏粘液乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌的比較基因組分析，揭示羅伊氏粘液乳桿菌含有產(chǎn)生羅伊氏素和鈷胺素的基因簇，是一種適應(yīng)性進(jìn)化的結(jié)果，有助于羅伊氏粘液乳桿菌益生菌特性的產(chǎn)生。Saulnier等通過比較不同來源（母乳、胃腸道和口腔）的羅伊氏粘液乳桿菌，表明功能基因的表達(dá)及其代謝途徑的激活可能促進(jìn)菌株在不同的環(huán)境中生長。由此可見，基因組測序和比較基因組分析有助于全面表征菌株的遺傳特征，揭示不同物種的進(jìn)化關(guān)系和基因差異。
方法
1.全基因組測序與分析
提取菌株AR673的基因組DNA，測量提取的總DNA的數(shù)量和質(zhì)量。采用高質(zhì)量DNA構(gòu)建DNA文庫，對文庫進(jìn)行測序、三代序列組裝，最終得到完整的染色體序列。生物信息學(xué)分析：對基因組中的tRNA和rRNA進(jìn)行預(yù)測，利用Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫、NR數(shù)據(jù)庫、GO、Pfam數(shù)據(jù)庫、COG、和KEGG數(shù)據(jù)庫6大數(shù)據(jù)庫分別進(jìn)行比對，對預(yù)測的蛋白質(zhì)編碼序列進(jìn)行功能標(biāo)注。通過Circos軟件繪制單個樣本基因組圈圖。以乳酸菌的16S rRNA基因序列為基礎(chǔ)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
2.比較基因組分析
采用BLASTN對乳酸菌菌株進(jìn)行全基因組比較。采用CD-HIT相似蛋白快速聚類軟件對核心基因和特異基因進(jìn)行分析。利用Hcluster_sg軟件對比對結(jié)果進(jìn)行基因家族聚類處理，進(jìn)行37個基因組同源性比較。采用整合原核生物基因組和泛基因組分析（IPGA）平臺進(jìn)行平均核苷酸一致性（ANI）分析。利用碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫分析37株菌的碳水化合物活性酶，使用在線云平臺chiplot繪制CAZymes熱圖。采用antismash軟件對菌株的次級代謝產(chǎn)物的合成基因簇進(jìn)行比較。
結(jié)果
AR673全基因組信息分析結(jié)果是，COG（圖3）和KEGG數(shù)據(jù)庫分別注釋到1 656個（圖3）和1 226個基因（圖4）。其中，功能注釋基因以代謝、遺傳信息進(jìn)程和環(huán)境信息進(jìn)程通路中注釋的基因最多。環(huán)境信息進(jìn)程通路中只有2類，基因數(shù)量最多的是膜轉(zhuǎn)運；遺傳信息進(jìn)程通路中功能基因主要定位于翻譯；代謝通路中基因數(shù)量最多的為碳水化合物代謝、輔因子和維生素的代謝和氨基酸代謝通路。AR673具有高達(dá)112個基因的碳水化合物代謝注釋量，表明該菌株可能在糖類分解和代謝功能中具有菌株優(yōu)勢。抗應(yīng)力分析發(fā)現(xiàn)羅伊氏粘液乳桿菌AR673含有一系列編碼溫度、pH值、膽鹽、滲透壓、氧化等應(yīng)激蛋白的基因（表2）。由此推測AR673可能具有耐酸、溫度脅迫、膽鹽脅迫、抗氧化的等特性，可能預(yù)示AR673在發(fā)酵工業(yè)中具有優(yōu)勢。
泛基因組分析結(jié)果顯示，37株羅伊氏粘液乳桿菌的泛基因組呈開放型狀態(tài)，數(shù)量為5 066個，可分為1 190個核心基因組（23.49%）以及1 167個菌株特異性基因（圖6）。37株菌株間菌株特異基因數(shù)量差異較大，菌株特異性基因的數(shù)量從僅在19-E-6、19-E-3、VHProbi E18、VHProbi M07中發(fā)現(xiàn)的0個基因簇到LL17所特有的173個基因簇不等，可能與不同寄主生存環(huán)境的差異有關(guān)。
羅伊氏粘液乳桿菌的泛基因組的擬合曲線（圖7），隨著菌株數(shù)量的增加呈上升趨勢，這可能是由于其在自然界中分布廣泛，與外界各種遺傳物質(zhì)發(fā)生交換，說明該物種有較高的遺傳多樣性，且具有對周圍環(huán)境和宿主的適應(yīng)性。其核心基因的數(shù)量隨菌株數(shù)量增加逐漸趨于穩(wěn)定，說明該物種的穩(wěn)定性較高。37株羅伊氏粘液乳桿菌的特異性基因數(shù)量有差異可能與其生長環(huán)境和代謝特性有關(guān)。
碳水化合物活性酶分析結(jié)果顯示，羅伊氏粘液乳桿菌可注釋到的CAZymes為4類：GH、GT、AA和CMB（圖8）。最普遍的CAZy分類為GH、GT。說明羅伊氏粘液乳桿菌有較高的糖、纖維素的合成能力，豐富的GHs表明其對宿主來源的碳水化合物的利用能力。
通過次級代謝產(chǎn)物分析，發(fā)現(xiàn)不同的羅伊氏粘液乳桿菌的次級代謝產(chǎn)物基因簇不同。主要預(yù)測到細(xì)菌素（Bacteriocin）、聚酮合酶（PKS）、和非核糖體肽合酶（NRPS）等次級代謝產(chǎn)物。其中，羅伊氏粘液乳桿菌Byun-re-01、I49、LL17、SKKU_OGDONS_0、FN041均含有細(xì)菌素合成基因簇，羅伊氏粘液乳桿菌FN041含有2個細(xì)菌素合成基因簇。羅伊氏粘液乳桿菌YLR001含有1個非核糖體肽合酶（NRPS）產(chǎn)生基因簇。37株菌均含有一個III型聚酮化合物合酶合成基因簇，能合成聚酮類化合物，可用于研制抗生素、抗菌劑等。次級代謝產(chǎn)物的分析為解釋羅伊氏粘液乳桿菌的抗菌活性提供了更有效的依據(jù)。
結(jié)論
本研究以羅伊氏粘液乳桿菌AR673為例，通過全基因組測序和比較基因組分析了羅伊氏粘液乳桿菌的基因組特征、系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化和可能存在的益生功能。COG和KEGG結(jié)果表明AR673可能具有巨大的翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生的潛力；在糖類分解和代謝功能中具有菌株優(yōu)勢。對抗應(yīng)力情況的研究顯示，AR673可能具有耐酸、溫度脅迫、膽鹽、氧脅迫的特性。37株羅伊氏粘液乳桿菌基因組比較分析顯示，羅伊氏粘液乳桿菌泛基因組呈開放型。次級代謝系統(tǒng)比較發(fā)現(xiàn)，37株菌共注釋到4類CAZymes，3種次級代謝產(chǎn)物。碳水化合物酶主要注釋到GH、GT家族，次級代謝產(chǎn)物中聚酮合酶、細(xì)菌素占多數(shù)。綜上所述，羅伊氏粘液乳桿菌AR673是一株具有多種益生功能的菌株，為后續(xù)羅伊氏粘液乳桿菌在食品工業(yè)中的開發(fā)和應(yīng)用提供了參考。
原文鏈接：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=mg_qcPBBapmbg71xWSJLk3UbkIfV_BmHxGA7Ws3GbKxirTXNrsNGfTvy3TA29EPYcgq0UZ8z70EfkSgGtaOWC-DKIs6LzwTXB7sIpPnaxlpggz7SEPLY74ZO_fpVZmnlmY8Q71atvvGqMcz0GF1n0aeHddLSiBj8D3g3qEGqKEiP9VhlME2ITQ==&uniplatform=NZKPT&language=CHS
